外泌體樣本的ELISA實(shí)驗(yàn)怎么做？
發(fā)布時(shí)間：2021-08-22 20:33:14來源：
外泌體（exosomes）是細(xì)胞分泌的微小囊泡，直徑約30-100nm，存在于大多數(shù)體液(如血液、尿液和脊髓液)和細(xì)胞培養(yǎng)液當(dāng)中。近年來，科研工作者在闡明外泌體的生理、病理生理功能及針對(duì)這些功能的臨床應(yīng)用方面開展了大量研究，尤其是疾病的診斷、治療應(yīng)用（如生物標(biāo)志物的開發(fā)）方面。研究表明，腫瘤細(xì)胞的外泌體會(huì)釋放與血管生成和免疫逃逸相關(guān)的分子標(biāo)志物，說明外泌體可能與腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的創(chuàng)建和促腫瘤生長有關(guān)1。此外，外泌體表面黏附分子的表達(dá)譜決定了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的終點(diǎn)2?？梢娡饷隗w在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的研究價(jià)值。
在外泌體課題研究中，定量分析自然是必不可少的一步。ELISA是一種較為簡單的檢測(cè)樣本中特定蛋白或細(xì)胞因子含量的方法。常見的ELISA檢測(cè)樣本有血清、血漿、組織、細(xì)胞上清等，那么外泌體樣本的ELISA（以下均簡稱exo-ELISA）如何檢測(cè)？應(yīng)用場(chǎng)景是什么？其原理是什么？與普通ELISA技術(shù)相比，exo-ELISA檢測(cè)有哪些不同？讓我們一起來看看。
一、雙抗體夾心法
將已知的外泌體表面分子（如CD9、CD63、CD81）作為標(biāo)志物，事先將特定外泌體分子標(biāo)志物的一抗包被于板底。當(dāng)加入一定濃度的含外泌體的樣本時(shí)，一抗就可以識(shí)別外泌體表面分子，實(shí)現(xiàn)捕獲外泌體的目的。e.g.常用的ExoELISA-ULTRA外泌體定量分析檢測(cè)試劑盒具有超高的靈敏度。
圖1. 雙抗體夾心法檢測(cè)exosomes原理示意圖
二、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）親和技術(shù)
已知Tim4（T細(xì)胞免疫球蛋白域和含粘蛋白域的蛋白4）可以通過位于細(xì)胞外區(qū)域的IgV結(jié)構(gòu)域與PS結(jié)合，并具有鈣離子依賴性3。而在螯合劑的作用之下，鈣離子與螯合劑的配位原子相結(jié)合，致使Tim4與PS分離開來。
與雙抗體夾心法不同的是，PS親和技術(shù)檢測(cè)exo-ELISA是使用磷脂酰絲氨酸事先包被的微孔板、生物素化的CD9、CD63、CD81一抗、親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，借助于抗原-抗體反應(yīng)、生物素-親和素的結(jié)合反應(yīng)來檢測(cè)待測(cè)樣本中外泌體含量的一種方法。與外泌體表面標(biāo)記的特異性抗體相比，Tim4能夠高效地捕獲來自多種細(xì)胞類型的外泌體。這種方法也適用于外泌體的純化。
圖3. 不同種類包被蛋白的檢測(cè)靈敏度對(duì)比
三、磁珠法
磁珠法的基本原理是采用生物素標(biāo)記的外泌體，親和素標(biāo)記的磁珠，利用生物素-親和素的結(jié)合反應(yīng)來對(duì)低外泌體含量的樣本（如尿液、細(xì)胞上清）進(jìn)行純化。
圖4. 磁珠法純化外泌體
四、基因工程的方法
DARPins是人工合成的由兩個(gè)α-螺旋和一個(gè)β-轉(zhuǎn)角的重復(fù)結(jié)構(gòu)組成的合成肽，被設(shè)計(jì)為受體蛋白等多種靶點(diǎn)（如：Her2）的結(jié)合域。DARPin -G3表達(dá)于慢病毒衣殼或細(xì)菌表面，被報(bào)道可用于腫瘤的靶向治療，是具有潛力的、可以克服單克隆抗體局限性的蛋白類治療因子。
Khodashenas等4用重組LAMP-DARPins包裝的慢病毒感染HEK293T細(xì)胞，使得外泌體表面表達(dá)重組嵌合蛋白。通過ELISA檢測(cè)外泌體表面重組抗原的表達(dá)，來表征外泌體的含量。DARPins-G3是專門針對(duì)表皮生長因子Her2設(shè)計(jì)而成的，因此可以用于檢測(cè)Her2+的SKBR3細(xì)胞外泌體的含量（圖5）。該方法用于外泌體的捕獲和純化過程。
圖5. 外泌體表達(dá)的DARPins與細(xì)胞表面Her2分子之間的反應(yīng)
注：用MDA231細(xì)胞作為Her2陰性對(duì)照細(xì)胞，SKBR3為Her2陽性細(xì)胞。
五、PD-L1液體活檢新方法的開發(fā)
研究表明，循環(huán)外泌體PD-L1水平可以區(qū)分腫瘤的存在，并與免疫治療的反應(yīng)有很好的相關(guān)性。2020年1月由楊朝勇教授4等開發(fā)的用于腫瘤液體活檢的外泌體PD-L1 ELISA檢測(cè)方法，通過篩選獲得的PD-L1核酸適配體，結(jié)合微量熱泳動(dòng)效應(yīng)，在較少的樣本體積、均質(zhì)性差的體液條件下，能夠獲得均質(zhì)、高效、高靈敏度的檢測(cè)結(jié)果。
篩選過程中發(fā)現(xiàn)，MJ5對(duì)癌細(xì)胞表面PD-L1的結(jié)合效果最好，且對(duì)PD-L1陰性細(xì)胞無明顯的結(jié)合。MJ5適配體經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化得到由33個(gè)核苷酸組成的、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的MJ5C。
流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，PD-L1陽性細(xì)胞MJ5C核酸適配體的熒光強(qiáng)度高于對(duì)照序列，PD-L1陰性細(xì)胞未見明顯的熒光增強(qiáng)（圖7A-B）。
結(jié)合親和力是指單個(gè)生物分子（如蛋白質(zhì)或DNA）與其配體（如藥物）之間相互結(jié)合的強(qiáng)度，通常通過平衡解離常數(shù) (Kd) 來衡量。Kd值越小代表配體與蛋白質(zhì)的親和力越大。結(jié)合親和力分析顯示：PD-L1陽性細(xì)胞MJ5C核酸適配體與對(duì)照核酸適配體的熒光強(qiáng)度比不僅遠(yuǎn)高于已報(bào)道的真核細(xì)胞選擇PD-L1蛋白的PD-L1適配體，而且比對(duì)照抗體的熒光強(qiáng)度比高約3倍（圖7C）。這些結(jié)果表明，MJ5C適配體不僅具有良好的選擇性，而且相比于PD-L1抗體組，它與PD-L1的結(jié)合效率更高。這種結(jié)合效率的提高可能是因?yàn)镻D-L1的空間位阻效應(yīng)，而MJ5C核酸適配體比PD-L1抗體小，因此較容易地避免了糖基化所產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)。
為了證明這一假設(shè)，首先用肽-N-糖苷酶F (PNGase F）處理細(xì)胞，以在被適配體或PD-L1抗體染色前削減總N-連接糖基化水平。適配體染色的2組（糖基化/去糖基化組）之間熒光強(qiáng)度無明顯變化；而與未處理相比，PNGase F處理后PD-L1陽性（HCT116）細(xì)胞的抗體染色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（圖7D-E）。這些結(jié)果表明PD-L1的糖基化阻礙了PD-L1抗體對(duì)其的識(shí)別，而PD-L1適配體MJ5C受空間位阻的影響較小，很可能是由于其體積減小了10倍。因此，與PD-L1抗體相比，MJ5C適配體具有更高的分子識(shí)別能力，可以顯著提高外泌體PD-L1檢測(cè)的敏感性。
圖7. MJ5C適配體與PD-L1抗體的結(jié)合性能比較
以上方法多是基于外泌體表面蛋白的檢測(cè)，那么研究某個(gè)蛋白分子A在外泌體中表達(dá)的基本邏輯思路是怎樣的呢？
首先，確定目的蛋白是位于外泌體囊泡內(nèi)還是囊泡表面。
如果目的蛋白位于囊泡表面，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)即可，不需要透膜劑處理。具體方法為通過磁珠包被的IgA或者IgG進(jìn)行捕獲，采用CD81/CD63/CD9等作為一抗進(jìn)行檢測(cè)。
如果目的蛋白位于囊泡內(nèi)部，則需要將分離得到的外泌體囊泡做破膜處理，類似于細(xì)胞破膜處理。即用含SDS的RIPA裂解液提取蛋白，然后進(jìn)行ELISA檢測(cè)。
所謂“細(xì)節(jié)決定成敗”，希望大家在實(shí)驗(yàn)過程中多思考，抓住細(xì)節(jié)，多發(fā)高分文章！
【參考文獻(xiàn)】
1. Tkach, M., & Théry, C. (2016). Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go. Cell, 164(6), 1226–1232.
2. Hoshino, A., Costa-Silva, B., Shen, T. L., Rodrigues, G., Hashimoto, A., Tesic Mark, M., Molina, H., Kohsaka, S., Di Giannatale, A., Ceder, S., Singh, S., Williams, C., Soplop, N., Uryu, K., Pharmer, L., King, T., Bojmar, L., Davies, A. E., Ararso, Y., Zhang, T., … Lyden, D. (2015). Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature, 527(7578), 329–335.
3. Miyanishi, M., Tada, K., Koike, M., Uchiyama, Y., Kitamura, T., & Nagata, S. (2007). Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor. Nature, 450(7168), 435–439.
4. Huang, M., Yang, J., Wang, T., Song, J., Xia, J., Wu, L., Wang, W., Wu, Q., Zhu, Z., Song, Y., & Yang, C. (2020). Homogeneous, Low-volume, Efficient, and Sensitive Quantitation of Circulating Exosomal PD-L1 for Cancer Diagnosis and Immunotherapy Response Prediction. Angewandte Chemie (International ed. in English), 59(12), 4800–4805.
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